花卉病毒病的初步诊断包括哪些方面?

　　1 症状初步诊断

　　花卉植物病毒病几乎都属于系统性侵染的病害，即当寄主植物感染病毒后或早或迟都会产生全株性病变和症状。病害的症状特点，对病害的诊断无疑是有很大的参考价值。此外在描述外部症状的同时还得注意环境条件、发病规律、传毒方式、寄主范围等特点，使对病害的诊断有个比较正确的结论。

　　2 花卉植物病毒病田间观察与分析

　　田间观察对病害的诊断有着重要意义。病毒病害在症状上容易与非侵染性病害，特别是缺素症、空气污染所引起的病害相混淆。病毒病害的植株在田间一般是分散分布，发病株附近可以见到完全健康的植株，植株得病后往往不能恢复，而非侵染性病害多数为成片发病，这种病害通过增加营养和改善环境条件可以得到恢复。植物病毒病害的另一个特点是只有明显病状而无病症，这在诊断上有助于区别病毒和其他病原生物所引起的病害。病毒病较少有腐烂、萎蔫的症状（一些细菌病害易发生腐烂症状），大多数病毒症状为花叶、黄化、畸形。

　　病毒病症状容易发生变化。不同病毒在不同的寄主或不同品种上，其症状及严重程度可以不相同；有些病毒病不表现症状，为隐症感染；病毒病症状在发展过程中会有变化，有些前期显症，后期隐症；有些一种病毒单独感染不表现症状，复合感染时症状和严重度发生变化；温度和光照条件也影响症状的表现，高温或低温会导致出现隐症。

　　3 内含体与病害诊断

　　植物细胞被病毒感染后会产生形状和组成都各不相同的结晶体或不定形体，称为内含体。植物病毒的这种内含体可以用作病害诊断。

　　内含体的检测方式可以先经固定，然后染色或表皮撕下后不经固定与染色直接在显微镜下观察内含体的外形。染色剂应用较多的有锥虫蓝、焰红和甲基绿等。

　　有些病毒侵染寄主后，其内含体在显示症状的叶片内很稠密，多数位于寄主的表皮层，也可发现于枝杆和花的外表皮内，或存在于叶的花叶区域。因此，早期调查应取这些部位的表皮。

　　植原体、螺原体等无壁菌门的原核生物造成的植物病害与植物病毒产生的症状相似，无病症表现，因此，它们又叫病毒类似病害。花卉上比较常见的是植原体病害，因此我们介绍一下植原体病害的诊断和鉴定。

　　1 超薄切片，电镜下观察植原体

　　方法如植物病毒的超薄切片和电镜观察。

　　2 抗生素治疗诊断

　　用四环素、土霉素和金霉素等对受病植株进行叶面喷施和灌根，植原体对这几种抗生素敏感，病害症状可以得到缓解。而植物病毒对抗生素不敏感，如果施用，对病害无效。

　　3 植原体PCR检测

　　根据植原体的共同保守序列，用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到植原体的特异扩增带。

　　还可以将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到与引物设计相符的植原体的特异扩增带，说明为植原体病害。

　　这里以仙人掌植原体丛枝病的PCR检测为例，介绍植原体的PCR检测技术。

　　实验操作如下：

　　Ⅰ.总核酸提取

　　（1）取0.3g植株幼嫩组织，用液氮冷冻后充分研磨成粉状。

　　（2）移入含有0.6ml预热到60℃的CTAB DNA提取缓冲液中，在60℃水浴中温浴30min。

　　（3）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），抽提30min。

　　（4）12000r/min离心8min，取上清液，重复（3）、（4）步直至蛋白质除尽。

　　（5）加入氯仿∶异戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min离心8min，取上清液。

　　（6）加入等体积预冷的异丙醇及1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.2），混匀，-20℃保持至少30min，14000r/min离心10min，使核酸沉淀。

　　（7）用70%乙醇洗涤2次后，.真空干燥。

　　（8）沉淀溶解于100μl TE缓冲液中。

　　（9）取10μl DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，计算DNA浓度。其余于-20℃冰箱中保存备用。

　　Ⅱ.PCR扩增

　　参照Lee所报道的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：

　　R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′

　　R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′

　　R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′

　　R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′

　　引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μmol/L。

　　直接PCR（Direct-PCR）：

　　（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列试剂

　　10×PCR反应缓冲液 5μl

　　5mmol/L MgCl2 4μl

　　2.5mmol/L dNTP 4μl

　　R16mF2（或R16F2） 3μl

　　R16mRl（或R16R2） 3μl

　　4U/μl 1TaqDNA聚合酶 1μl

　　模板 2μl

　　加入双蒸水至终体积为50μl，混匀并加入30μl石蜡油。

　　（2）PCR扩增。反应循环为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存。

　　（3）取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

　　巢式PCR（Nested-PCR）：

　　将用引物对R16mF2/R16mRl扩增的直接PCR产物按1∶40比例稀释后，作为反应模板，引物对换为R16F2/R16R2，退火温度升高至60℃，其余反应条件同直接PCR。

　　Ⅲ.结果

　　用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到一条约1.5kb的特异扩增带（图1）。通过实验，用泡桐丛枝作为植原体的阳性对照，检测出YNOl样品（仙人掌品种珊瑚枝丛枝）和YNO2（仙人掌品种堆罗汉丛枝）为植原体病害。其他YNO3（仙人掌品种猪耳掌丛枝）、YNO4（仙人掌品种金狮子丛枝病）、YNO5（仙人掌品种青海波丛枝）不是植原体病害，可能为品种的特性。

　　图1 直接PCR扩增结果

　　将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到一条约1.2kb的特异条带，与引物设计相符（图2），说明为植原体病害。直接PCR的检测灵敏度为10pg DNA，而巢式PCR可以提高检测灵敏度。使用直接PCR的检测得到比较模糊条带的，使用巢式PCR可以得到非常明显的条带。

　　图2 巢式PCR扩增结果